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Sur les 11 séances de TP, les étudiants vont cloner le gène de la GFP (Green Fluorescent Protein) et le faire exprimer par des bactéries (illustré dans la figure A) pour ensuite analyser le produit de ce gène par une approche biochimique (illustré dans la figure B). Ces TP permettent d’aborder les techniques classiques de biologie moléculaire pour le clonage d’un gène (PCR, enzyme de restrictions, purification d’ADN…), de manipuler des organismes vivants de par l’utilisation de bactéries (précautions spécifiques) et de voir les atouts de la bactériologie pour l’expression de protéines d’intérêt (transformation des bactéries, crible des clones obtenus, induction spécifique de la protéine d’intérêt…), et d’utiliser les techniques classiques de laboratoire pour l’analyse des protéines (extraction, gel d’électrophorèse, western-blot avec anticorps fluorescents).
Enfin, tout au long de ces TP, des rappels des principes théoriques nécessaires aux techniques vues en pratique sont fait avec le maximum d’interactivité et d’échanges avec les étudiants puisque ces connaissances ont déjà été traitées lors des cours magistraux (utilisation d’un tableau interactif).
(A) Boite de Pétri illuminée avec des UV permettant de visualiser les bactéries transformées avec un plasmide contenant le gène de la GST fusionné ou non avec celui de la GFP. Une colonie exprimant la GFP et une n’exprimant pas la GFP sont prélevées et remises en culture pour analyse de leur génotype par PCR et de leur phénotype par immuno-blot.
(B) Immuno-blot permettant de quantifier l’efficacité de l’induction de l’expression de la protéine GST ou de la protéine de fusion GST-GFP après extraction des protéines desbactéries. Le signal vert correspondant aux anticorps fluorescents anti-GST (vert) est normalisé par rapport au signal rouge (anticorps contre une protéine bactérienne la GAPDH).
